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2010-07-22 外源基因在真核细胞中的表达系统
1. 真核生物表达的优越性和必要性 ① 真核生物具有转录后加工系统,可识别并删除基因中的内含子,剪切加工为成熟mRNA. ②具备完善的翻译后加工系统,可进行糖基化、乙酰化等修饰,使蛋白形成正确的天然构型,因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态,有利于其功能、生物活性的研究。 ③某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中,简化了纯化工艺,降低了生产成本。
2010-07-22 外源基因在原核细胞中的表达系统
外源基因在原核细胞中表达是基因工程操作中最初取得成功的途径。
2010-05-24 基因工程常用的工具酶
一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase) 逆转录酶(reverse transcriptase)
2010-04-21 重组质粒的构建
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
2010-04-10 植物基因转化技术
植物基因转化技术是指将外源基因导入植物细胞或组织,获得转基因植物的技术。植物基因转化技术总体上可分为两大类:1 以生物体为介导的基因转移法;2 DNA直接导入法。前者如农杆菌介导法,植物病毒介导法;后者如基因枪法、电击法、聚乙二醇法、脂质体法及花粉管通道法。其中应用最广的是根癌农杆菌介导法。
2010-04-06 线虫unc-22突变基因的克隆实验原理和操作步骤
(一) 引物设计 (二) 目的基因片段的PCR扩增 (三)目的基因片段PCR产物的纯化回收 (四)目的基因片段与克隆载体的连接 (五)连接产物的转化 (六)重组质粒的筛选 (七) 重组质粒的测序验证
2010-04-06 家蚕油蚕突变基因的克隆
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下,有Mg2+ 、ATP存在的连接缓冲系统中,将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定,挑选出所需的重组质粒。
2010-04-06 果蝇白眼突变基因的克隆
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下,有Mg2+ 、ATP存在的连接缓冲系统中,将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定,挑选出所需的重组质粒。
2010-04-06 转化克隆的筛选和鉴定
利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。
2010-04-06 目的基因片段与载体连接
在Mg2+和ATP存在下,T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。
2010-03-29 基因工程的载体和工具酶
第一节载体 一、质粒载体 (一)质粒的生物学特性 (二)质粒DNA的制备 (三)质粒载体的改造 二、噬菌体载体 (一)l噬菌体载体 (二)M13噬菌体 (三)柯斯质粒载体 第二节基因操作的工具酶 一、限制性核酸内切酶及其应用 (一)限制性核酸内切酶的发现 (二)限制性核酸内切酶的分类 (三)限制性核酸内切酶的命名 (四) II型限制性核酸内切酶的基本特性 (五)限制性核酸内切酶的消化反应 二、 DNA连接酶及其应用 (一)DNA连接酶的发现 (二) DNA连接酶作用特点 (三) DNA连接酶的反应条件 (四)T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案 三、DNA聚合酶及其应用
2010-03-29 DNA的重组连接实验原理和步骤
重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中,将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。
2010-03-25 基因克隆技术(Gene Cloning Techniques)
一、目的基因的获得 (一)采用限制性酶切法直接分离目的基因 (二)采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因 (三)基因组文库或cDNA文库的构建和筛选 (四)化学合成法制备基因片段 二、目的基因和载体的连接 (一)PCR产物的克隆策略 (二)外源DNA片段和载体的连接 三、重组分子的扩增和鉴定 (一)重组DNA分子导入受体细胞 (二)重组DNA分子的鉴定
2010-03-25 体外DNA重组技术
一、基因组DNA的制备 (一)从哺乳动物组织中提取基因组DNA (二)从植物组织中提取基因组DNA 二、RNA的制备 1.异硫氰酸胍法 2.Trizol试剂法:原理、试剂、器材. 三、质粒DNA的制备 四、DNA酶切,电泳分离与片段的回收 五、载体与DNA片段的连接反应 六、重组质粒的转化
2010-03-23 PCR产物的T载体克隆
(一)重组T质粒的构建 (二) 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定
2010-03-21 PCR扩增产物的克隆技术
利用各种PCR技术扩增特异DNA是获得目的基因和特异探针的一种最有效、最简便的方法。但PCR扩增出的片断如不经进一步克窿是无法变成可利用基因,因此PCR扩增产物的克窿技术是DNA重组技术中的一个最重要部分,该技术是目前分子生物学实验中最重点内容,要综合前面实验中所介绍的各种技术,起着承上启下的作用。PCR产物的克隆一般要经过PCR产物的纯化、产物与载体的酶切、脱磷及连接、转化、筛选等几个步骤实现。
2010-03-21 基因的重组连接技术
DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术,该技术是基因重组,基因改造的重要中间环节。在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接;2) 接头与DNA片断的连接,这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。
2010-03-21 基因克隆技术(Gene Cloning Techniques)
一、聚合酶链式反应技术 二、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 三、特异扩增片段的回收纯化 四、目的片段与载体的连接 五、连接产物的转化 六、质粒DNA的提取(碱裂解法)
2010-03-21 目的基因的获取
基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群中,根据需要分离出用于克隆的此类基因。这类基因称之为目的基因,即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
2010-03-21 基因克隆技术(Gene Cloning Techniques)
基因克隆技术是分子生物学的核心技术,其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,用于深入分析基因的结构与功能,并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术,它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割,重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。

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