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RNA提取方法步骤及常见失败原因

2010-04-20 09:49:17 来源:易生物实验 浏览次数:0 网友评论 0

研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT- PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

目的
研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT- PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

主要试剂
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出 的核酸酶

1. Trizol试剂含有苯酚,具有毒性和刺激性,注意操作。
2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,注意配带手套,样品尽可能盖严;
3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率,因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。
4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构,可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡,使细胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。

准备工作
RNA酶(Rnase)是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定,在一些极端的条件下只可暂时失活,但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。
1.它广泛存在于人的皮肤上,因此制备RNA时必须戴2.手套RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造
商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(1)塑料制品:尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不
必再处理。

处理的步骤如下:

Ø在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使其终浓度为 0.05%~0.1%(DEPC-H2O)。(DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物,须在通风橱中小心使用)
Ø 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC-H2O,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中,在通风柜中 37℃ 或室温下处理过夜。
Ø 将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中,将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口,高温高压蒸 汽灭菌至少30分钟。
Ø 灭菌塑料制品烘烤干燥,置洁净处备用。

(2)玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。

DEPC(二乙基焦碳酸酯)

ØDEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。
ØDEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。
Ø试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。
Ø但DEPC能与胺和巯基反应,因而含TrisDTT的试剂不能用DEPC处理。

实验步骤如下:

1. 取50~100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂,用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。
2. 将匀浆室温放置5 min。
3. 加入200 μl 氯仿,剧烈震荡混匀 30s,冰上静置3 min。
4. 12000 rpm,4℃ 离心15 min。
5. 将上清液小心转移到新的 1.5 ml离心管中(取400 μl ),加入等量体积的异丙醇,上下颠倒几次混匀,室温下放置15 min。(此步中注意:不要吸取任何中间层物质,宁缺勿烂。)
6. 12000 rpm, 4℃ 离心15 min 。
7. 小心移去上清液,防止RNA沉淀丢失。
8. 用70%乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤1次,加入700 μl乙醇,将RNA沉淀弹起,漂洗。(此时RNA是不溶解的)
9. 8000 rpm,室温离心10min。
10. 尽可能彻底地吸走上清,防止RNA沉淀丢失。
11. 真空离心干燥3~5分钟,或放在室温下使乙醇完全挥发掉。
12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶,68 ℃处理10 min。
13. RNA检测
(1) 测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。
OD260/OD280 在1.8-2.0 。
(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。

低得率 A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 A.检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而 是溶于水。低离子浓度和低pH条件下,A280值会较高。
B.样品匀浆时加的试剂量太少。
C.匀浆后样品未在室温放置5分钟。
D.水相中混有有机相。
E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解 A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.样品或提取的RNA沉淀保存于-5--20℃,未在-60--70℃保存。
C.细胞在胰酶处理时被破坏。
D.溶液或离心管未经RNase去除处理。

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